Совместная работа с документами в облаке. «МойОфис» — облачная работа с документами стала еще проще
Культивирование вирусов в лаборатории возможно:
Культивирование вирусов в организме лабораторных животных: лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных выводят из эксперимента, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных.
Культивирование вирусов в куриных эмбрионах: большинство известных вирусов обладают способностью реплицироваться в курином эмбрионе. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования.
Культивирование вирусов в тканевых культурах: клеточная культура– система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии.
Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.
Сущность методов при приготовлении первичных культур тканей заключается в разрушении межклеточной ткани и разобщения клеток для последующего получения монослоя. Разобщение клеток проводится путём воздействия на ткань протеолитических ферментов (трипсина).
Методы индикации вирусов:
Нейтрализации цитопатического действия (ЦПД);
Нейтрализация реакции гемадсорбции;
Торможение реакции гемагглютинации;
Нейтрализация в опытах на животных.
Серологические– для обнаружения как специфических Ат, так и вирусных Аг;
ПЦР(полимеразная цепная реакция) - данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей;
Люминисцентная микроскопия;
Метод цветной пробы.
Практические навыки: этапы окраски мазка по Граму, какие свойства изучаются, интерпретация результатов
Этапы окраски по Граму:
- генцианвиолет (40 сек)
- раствор люголя - спирт 96˚ (20-25 сек)
- промывка водой
- фуксин (2-3 мин)
- капля масла
Тинкториальные свойства – отношение к окраске по Граму. Различают Грам +(синего цвета) и Грам – (красного цвета) Из-за многослойного муреинового каркаса Грам+ не успевают обесцветиться спиртом и окрашиваются в синий цвет, а Грам – обесцвечиваются спиртом и докрашиваются фуксином в красный цвет.
№14
Основные методы диагностики инфекционных болезней
1. Бактериоскопия (микроскопия), вирусоскопия(электроннаямикроскопия)
2. Бактериологическое (выделение чистой культуры).
4. Биологический метод (заражение животных).
5. Вирусологическая диагностика (выделение вирусов и токсинов):
А) цитопатическое действие на культуру клеток (ЦПД);
Б) реакция нейтрализации летального эффекта на чувствительных животных и куриных эмбрионах;
6. Серологическая диагностика (идентификация при помощи иммунной диагностической сыворотки):
A) реакция агглютинации развернутая (РА);
Б) ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации;
B) реакция непрямой гемагглютинации (РНГА);
Г) реакция гемагглютинации (РГА) и реакция гемадсорбции (РГАдс);
Д) реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и гемадсорбции (РТГАдс);
7. Иммунологическая диагностика (идентификация антигенов и антител):
A) имуноферментный анализ (ИФА);
Б) иммуноферритиновая реакция;
В) реакция преципитации (РП):
Г) иммуноблотинг;
8. Метод генной диагностики:
· полимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амплификация
9. Экспресс-методы:
А) иммунологический (МФА,.РНТА, ИФМ);
Б) бактериоскопический.
10. Алергологическая диагностика:
А) Кожные пробы со специфическими аллергенами (тулярин, туберкулин, бруцеллин, дизентерии).
Этапы лабораторной диагностики вирусных болезней. Устройство вирусологической лаборатории.
1) Индикация (обнаружение) вируса в патматериале:
Экспресс-методы:
a) Обнаружение вирионов:
(1) Электронной микроскопией;
(2) Световой микроскопией (оспа);
b) Обнаружение вирусных АГ в серологических реакциях (РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА);
c) Обнаружение телец-включений методами световой и люминесцентной микроскопии;
d) Обнаружение вирусных нуклеиновых кислот методами ПЦР, ДНК-зондов;
e) Обнаружение гемагглютининов в РГА;
f) Обнаружение инфекционной активности вируса в биопробе.
2) Изоляция (выделение) вируса из патматериала. Изоляцию проводят независимо от результатов первого этапа методом биологической пробы в трёх «слепых» пассажах. Пассаж – это заражение живой системы, с целью получения новой популяции вируса. «Слепой» пассаж – заражение без видимых признаков репродукции вируса. Через три пассажа в клетках живой системы происходит накопление вируса, что сопровождается появлением признаков репродукции, видимых на уровне макроорганизма. Например, при биопробе на животных : клинические признаки, гибель, патизменения; на куриных эмбрионах – гибель, патизменения, гемагглютинация; на культуре клеток – ЦПД, гемадсорбция, бляшки, РИФ и др. Такие зараженные живые системы определяют как положительная биопроба. Однако точно установить вид инфекционного агента еще нельзя. Поэтому от положительной биопробы отбирают патологический материал, который условно считают вторичным, т.е. отобранным из живой системы с признаками положительной биопробы. Из него готовят вируссодержащую суспензию или мазки-отпечатки (выделенный вирус).
3) Идентификация (определение вида) выделенного вируса в серологических реакциях или методом ПЦР-анализа. В редких случаях возможна идентификация по другим признакам, например по внутриклеточным включениям (тельца Бабеша-Негри для бешенства).
4) При необходимости – доказательство этиологической роли выделенного вируса. Для этого применяют серологические реакции, в которых в качестве антигена используют выделенный вирус и в качестве антител – парные пробы сыворотки крови в двукратных последовательных разведениях. Положительным результатом, доказывающим этиологическую роль выделенного вируса, является увеличение титра антител во второй пробе сыворотки крови по сравнению с первой в 4 и более раз.
5) Ретроспективная диагностика. С этой целью используют парные сыворотки крови, взятые на этапе выздоровления, которые исследуют в серологических реакциях со стандартным специфическим антигеном в соответствии с предварительным диагнозом на вирусную болезнь. Нарастание в 4 и более раз титра антител во второй пробе по сравнению с первой свидетельствует об активном инфекционном процессе, протекающем в организме животного в период взятия у него крови. При этом болезнь вызвана тем вирусом, к которому установлено повышение титра антител в парных сыворотках.
Устройство вирусологической лаборатории.
Для организации диагностической лаборатории используют изолированный отсек, состоящий не менее чем из 5-6 комнат.
Под лабораторию отводят светлое помещение. Комнаты для работы с вирусным материалом должны быть хорошо освещены и состоять из предбоксника и бокса, разделенных стеклянной перегородкой с дверьми. В боксах размещают только столы, стулья и принадлежности для работы. Поверхность столов покрывают нержавеющей сталью, пластиком или стеклом, а над рабочей поверхностью устанавливают бактерицидные лампы. У входа в бокс кладут резиновый губчатый дезковрик, пропитанный дезраствором. В предбокснике лежат стерильная одежда и оборудование, соответствующее назначению бокса. Лабораторию обеспечивают холодной и горячей водой и вентиляцией с подачей стерильного воздуха.
Для регистрации поступающего патматериала предназначена приемная, где размещают несколько столов, обитых оцинкованной жестью, и емкости с дезрастворами (3% хлорамина, натрия гидроксида или 5% фенола).
В комнате для предварительной обработки материала (вскрывочной ) вскрывают трупы и отбирают материал для дальнейшего исследования.
Комнаты-боксы оборудуют в зависимости от назначения.
В автоклавной стерилизуют посуду, питательные среды, аппаратуру, питательные среды и обезвреживают инфекционный материал. Необходимо иметь два автоклава: для чистых материалов и для инфицированных.
Моечная предназначена для мытья посуды, аппаратуры и приборов.
Виварий должен иметь карантинное отделение, комнаты для здоровых и экспериментальных животных и подсобные помещения.
Для вирусологической лаборатории любого типа обязательной частью лаборатории является настольный бокс или лучше бокс с ламинарной подачей воздуха.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ - учреждение, занимающееся изучением вирусов и вирусных заболеваний или производством вирусных препаратов (вакцин, диагностикумов, противовирусных иммунных сывороток и т. п.).
В. л. отделились от бактериологических и стали существовать в виде самостоятельных единиц в 20 в. В СССР первые В. л. были созданы в 30-х годах. Сейчас в стране имеется несколько ин-тов мед. вирусологии, объединяющих В. л. различных профилей, где изучаются вирусные заболевания, исследуется природа вирусов, разрабатываются и производятся вирусные препараты (Ин-т вирусологии им. Д. И. Ивановского, Ин-т полиомиелита и вирусных энцефалитов, Всесоюзный НИИ гриппа, Московский НИИ вирусных препаратов и др.). В. л. есть также в большинстве союзных и республиканских ин-тов микробиологии и эпидемиологии, обычно профилированных в отношении изучения одного или нескольких заболеваний. Кроме того, имеется ок. 150 В. л. при республиканских, областных и городских сан.-эпид, станциях, а также лаборатории при крупных леч. учреждениях; в основном они занимаются диагностической работой. Помимо мед. В. л., существуют лаборатории для изучения вирусных инфекций животных и растений.
Размеры и штаты В. л. зависят от назначения и объема работы. Во всех случаях обязательно обеспечение безопасности персонала и возможности проведения работы в стерильных условиях.
В. л. состоит из собственно лаборатории и подсобных помещений - для обработки и стерилизации посуды, приготовления питательных сред (для выращивания клеточных культур, выявления бактерий и мико-плазм), лиофилизации вирусов, инкубатора, вивария и др. Если В. л. входит в состав более крупного учреждения (ин-та, сан.-эпид, станции и др.), подсобные помещения могут быть общими для ряда лабораторий или всего учреждения.
Собственно В. л. строится по типу бактериологической лаборатории (см.) с учетом специфики работы - выращивания клеточных и тканевых культур, ультрацентрифугирования, хранения вирусов при низких температурах и др. Она оборудуется для диагностической работы (выделения вирусов и серологических реакций), для изучения свойств вирусов, их структуры, проведения генетических исследований и т. п.
Помещение В. л. должно легко мыться и обрабатываться дезинфицирующими растворами. С этой целью стены красят масляной краской или облицовывают плиткой, пол покрывают линолеумом или плиткой. Помещение оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией примерно с 10-кратным обменом воздуха; оно должно быть обеспечено холодной и горячей водой, а также светильным газом. Желательно иметь централизованную систему сжатого воздуха (давление до 1,0-1,2 атм) и вакуума (до 700- 760 мм рт. ст. остаточного давления). Должны быть предусмотрены душевые комнаты для сотрудников. При работе с особо опасными вирусами необходимо обезвреживание (путем кипячения) сточных вод.
В В. л. обязательно наличие отдельного помещения для стерильной работы, состоящего из двух отделений, разделенных стеклянной перегородкой. Внутреннее помещение - бокс- должно быть небольшим (6-8 м 2), с низким потолком (см. Боксы , микробиологические). Дверь должна открываться в предбоксник, служащий для одевания дополнительной одежды, отделенный второй перегородкой от остального помещения. Для стерилизации бокса и предбоксника используют бактерицидные лампы из увиолевого стекла с преобладающей длиной волны 254 нм (см. Бактерицидные облучатели). Для этой цели можно использовать лампы БУВ, которые устанавливают из расчета 2-2,5 вт на 1 м 3 помещения; средний срок службы лампы 1500 час. Обязательно обеспечение боксов стерильным воздухом за счет приточной вентиляции при 4-5-кратном обмене; для стерилизации воздуха могут быть использованы фильтры ЛАИ К из ткани Петрянова - тип ФПП.
В боксе должны находиться лишь необходимые для работы инструменты и посуда, стерилизатор для инструментов, широкогорлые банки с дезинфицирующим раствором, бак с крышкой для зараженного материала. При работе с возбудителями особо опасных инфекций (натуральная оспа, энцефалиты и т. д.) в боксе устанавливают дополнительно настольный бокс, в к-ром стерилизуется путем фильтрации как поступающий, так и оттекающий воздух. Основные правила работы с особо опасными возбудителями регламентируются специальной инструкцией.
Для дезинфекции в В. л. используют чаще всего лизол 1 - 5%, хлорамин 1-5%, формалин 2,5-5%.
Помимо обычной бактериологической посуды, В. л. должны иметь гомогенизатор для измельчения тканей, магнитные мешалки, микроскопы (световые для исследования в обычном и ультрафиолетовом свете, а также электронные), центрифуги различной мощности (на 3-5 тыс. об/мин, а также с охлаждением на 12-15 тыс. и 60 тыс. об/мин), имеющие набор роторов. Необходимы термостаты, одновременно работающие при различной температуре (от 25 до 40°), в т. ч. с подачей углекислого газа, или термостатные комнаты. В. л. оборудуется рефрижераторами или холодильными камерами с t° +4°, -20° и -40°. Для хранения культур клеток необходимы сосуды Дьюара с жидким азотом или холодильники с температурой ниже -90°.
Лаборатории, изучающие биохимию вирусов, оборудуются по типу химических. Работа с радиоактивными изотопами производится в специально оборудованном помещении.
В отделениях по приготовлению сред, помимо обычной хим. посуды, необходимо иметь установки для обработки воды, к-рая дважды дистиллируется в стеклянных аппаратах или деионизируется на колонках с ионообменными смолами. Для стерилизации растворов, которые нельзя автоклавировать, используют асбестобумажные стерилизующие пластины Зейтца, вмонтированные в фильтры типа Сальникова (Ф-140, ФС-3, ФС-7 и т. п.); фильтрация осуществляется при давлении 0,5 атм. С той же целью можно использовать стеклянные пластины (свечи) и фильтры «Миллипор» с величиной пор от 0,22 до 1,2 мкм (см. Бактериальные фильтры).
Виварий (см.) должен быть отделен от помещения собственно В. л. В нем необходимо иметь комнаты для карантина поступающих животных, для их заражения и отдельно для вскрытия. Работа с мелкими лабораторными животными производится за защитным стеклом. Обеззараживание клеток для содержания животных лучше производить паром. Необходимо также иметь крематорий для сжигания трупов животных и мусора.
Библиография: Кравченко А. Т. Принципы организации и режим работы вирусологических и риккетсиозных лабораторий, Руководство по Лаборат, диагностике вирусных и риккетсиозных болезней, под ред. П. Ф. Здродовского и М. И. Соколова, с. 219, М., 1965; Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., с. 9, 123 и др., М., 1974; Guide to the laboratory diagnosis of smallpox for smallpox eradication programmes, Geneva, WHO, 1969; Virologische Praxis, hrsg. v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.
Когда-то на биофаке ходила легенда, что в лаборатории 4ого уровня безопасности в СССР недосчитались 2-х «пробирок» с опасным инфекционным заболеванием. Пытались найти человека, который с ними работал, но он уехал в отпуск. Паника продолжала нарастать и достигла своего апогея, когда директору позвонили из Ялты и сказали, что у нас тут труп вашего сотрудника, пожалуйста, приезжайте за ним. Ответ директора был короткий и логичный: «Мы к вам не поедем, и Вы, пожалуйста, тоже к нам не приезжайте». Говорят, что в уме он прикидывал расстояние до Ялты. Позже выяснилось, что сотрудник очень торопился и забыл отметить, что образцы были утилизированы, а в Ялте он, к сожалению, утонул. Вспышка опасной болезни была остановлена:) .
Но все-таки интересно, как выглядят лаборатории, в которых хранятся и изучаются самые опасные заболевания. В международной практике существует 4 уровня лабораторий для работы с биологическими патогенами. Все мы знаем значок Biohazard или биологической опасности.
Однако, далеко не всегда то, что хранится за ним опасно для нашей жизни. Это могут быть любые биологические клетки или субстанции, которые потенциально могут воздействовать на живые организмы. Поверьте, если за дверью скрываются действительно опасные объекты, туда просто так не зайти.
Начну по порядку. Самые простые и неопасные - это лаборатории 1го уровня. В них работают с культурами клеток, вирусами и бактериями, которые считаются неинфекционными. Они не должны быть отделены от основного здания, и работники применяют простые средства защиты: халат, перчатки и частичная защита лица.
2ой уровень защиты в целом похож на 1ый, но там уже должен быть ограниченный доступ во время работы, и все манипуляции проводятся в специальных ламинарах. В таких лабораториях изучают инфекции, которые вызывают слабые заболеваниями, а также те, которые точно не передаются воздушно-капельным путем. Например, это некоторые гепатиты, обычные штаммы гриппа, сальмонелла.
На 3ем уровне становится интереснее. Тут уже строгое ограничение на доступ, вход в лабораторию с двойными дверями и тамбуром, это позволяет ограничить обмен воздухом между помещениями. Когда в лаборатории кто-то работает, то в нее не могут попасть другие люди. Вы, наверное, видели в фильмах, что другие сотрудники обычно стучат в дверь, чтобы тот, кто находится внутри им открыл. Это вовсе не означает, что у человека снаружи нет доступа, просто во время исследований, никто не должен туда проходить, вот они и стучат, пытаясь изобразить кота Шрека, чтобы их пустили. Все перемещения патогенов регламентированы и должны проводится только в специальных ламинарах. Воздух проходит обработку и не должен смешиваться поступать в вентиляцию основного здания. Одежды на сотрудниках становится больше (как правило, лицо, голова и руки должны быть закрыты максимально, а халаты не имеют пуговиц спереди, а только завязки сзади). После работы одежда подвергается обработке, но, все-таки, это пока еще не костюм индивидуальной защиты. В таких лаборатория уже можно найти смертельно-опасные заболевания, против которых есть вакцины или эффективное лекарство. Например, желтая лихорадка, западно-нильский вирус и возбудители туберкулеза.
4 уровень предназначен для работы с самыми опасными и заразными вирусами и бактериями, против которых не существует лечения. ВОЗ описывает их дизайн, как чрезвычайно сложный и, поэтому избегает давать какие-либо схемы.Сегодня в них содержатся, в основном, разнообразные геморрагические лихорадки, в том числе Эбола и вирус Марбурга. Вот тут уже появляются полностью герметичные костюмы индивидуальной защиты с избыточным давлением (поэтому люди выглядят как надутые резиновые игрушки). Избыточное давление нужно, чтобы в случае повреждения, воздух устремился из костюма и препятствовал попаданию воздуха из лаборатории в костюм. В самой же лаборатории наоборот поддерживается немного пониженное давление, чтобы в случае разгерметизации комнаты воздух ее не покидал.
Существуют и дополнительные правила работы, например, в таких лабораториях запрещается в одиночку, присутствие напарника обязательно. Начиная с лаборатории третьего уровня каждый сотрудник должен носить с собой специальную карточку-памятку в которой указаны телефоны тех, кому он должен позвонить в случае подозрительных симптомов, а так же указания для лечащего врача. Если вы решили пообщаться с кем-то вне лаборатории, от для этого придется использовать специальную связь - докричаться, увы, не получится.
Переодевание - целый ритуал в лабораториях высокого уровня безопасности. Как и в лабораториях 3его уровня вся одежда полностью снимается и после душа надевается что-то вроде костюма медперсонала. Одна из забавных деталей во время переодевания в спецодежду - это заклеивание скотчем границы между носками-штанами и перчатками-рукавами, кстати, штаны заправляются в носки (прямо бэтменом можно себя почувствовать). После скотча надевается сам герметичный костюм и подключается к источнику воздуха. В фильмах, где показываются подобные лаборатории, иногда видно, что от костюма к потолку тянется спирально закрученный шланг, собственно через него и поступает воздух в костюм. Самое сложное во время работы - не запутаться в этом шланге, как обычно это происходит с пылесосом подключенном к сети. Только вот цена ошибки другая.
Чтобы попасть в эту лабораторию, нужно пройти все семь кругов ада уровни защиты: многочисленные души, вакуумную комнату, облучение ультрафиолетом и все то, на что хватит фантазии разработчика (это одна из немногих профессий, где паранойя приветствуется). Говорят, что высший пилотаж, это когда нужно поднырнуть под стену через бассейн. Современные костюмы достаточно удобны для манипуляций, но в любом случае надо тренироваться, так как даже такое простое действие как сесть на стул может вызвать затруднение - ведь вы плохо чувствует, что происходит вокруг. Но есть еще одно важное неудобство, прежде чем войти в лабораторию (а, как видите процесс это не такой уж и просто), нужно хорошенько подумать, ведь в помещениях 4ого уровня защиты нет туалетов … , так что придётся терпеть до конца эксперимента:) (от питья водички, видимо, лучше тоже воздержаться).
После работы нужно вместе с костюмом пройти через химический душ, чтобы уничтожить все образцы (душ займет несколько минут, так что, если кто-то все-таки не удержался и попил водички до, то эти минуты могут показаться вечностью:)). Далее обычный душ и переодевание в гражданскую одежду.
В качестве примера подобной лаборатории хочу привести инфографику западных иллюстраторов :
Интересен и план действия на разные внештатные ситуации. Например, случае разгерметизации в вентиляцию начинают поступать агенты, которые должны деактивировать любые патогены. Как правило, это достаточно агрессивные соединения, например перекись водорода и формальдегид, поэтому материалы, из которого построено здание должны быть устойчивы к ним (дерево и цветастые обои тут не подойдут, но стильные решения все-таки можно найти).
По понятным причинам в такие лаборатории журналистов и сочувствующих им не пускают, поэтому увидеть лабораторию изнутри практически невозможно. Однако, в Бостоне до начала эксплуатации новой лаборатории 4ого уровня, по ней провели экскурсию и рассказали какие меры предосторожности в ней применяются. Увидеть этот удивительный тур можно на видео, но, к сожалению, оно на английском.
Лабораторий 4ого уровня не так уж и много. На сколько мне известно, в США их пятнадцать, а в России есть только одна, это «Вектор» в Кольцово (Новосибирск). Ее уникальность в том, что только в двух лабораториях в мире: в «Векторе» и в Центре по контролю и профилактике заболеваний США хранятся штаммы натуральной оспы. Периодически поднимается вопрос об их полном уничтожении, но до сих пор финальное решение не принято.
Несмотря на страх людей перед вирусами и бактериями, который бережно культивируется телевидением, они не так уж ужасны, как принято думать. Наши страхи рождаются не вирусами, а незнанием. Сколько людей отказывались просто общаться с ВИЧ-инфицированными, хотя это абсолютно безопасно. Самое главное - следовать рекомендациям и инструкциям. Все заражения, которые происходят в подобных лабораториях, являются не следствием ошибки системы или компьютера, а результатом человеческой халатности. Поэтому внимательно читайте и слушайте инструкции по безопасности, и с вами все будет хорошо:).
Все интересующиеся тематикой могут заглянуть в :)
